重組蛋白表達(dá)完成后，初步檢測表達(dá)情況常用的方法（如SDS-PAGE、WesternBlot）中，樣品制備環(huán)節(jié)需要避免哪些操作誤差？
日期：2025-09-23 11:04:05
在重組蛋白表達(dá)完成后，采用SDS-PAGE、Western Blot等常用方法初步檢測表達(dá)情況時，樣品制備環(huán)節(jié)需要避免以下操作誤差：
1、細(xì)胞或組織裂解方面
（1）避免裂解不充分：
如果采用物理破碎方法（如超聲破碎），超聲功率設(shè)置過低、超聲時間過短，都可能導(dǎo)致細(xì)胞未能充分破碎，使得部分重組蛋白仍留存于未裂解的細(xì)胞內(nèi)，無法釋放到裂解液中被后續(xù)檢測到。例如，對于一些細(xì)胞壁較厚的微生物表達(dá)體系，若超聲參數(shù)不合適，就容易出現(xiàn)這種情況。
化學(xué)裂解時，裂解液的配方選擇不當(dāng)，比如其中的去污劑、鹽濃度等關(guān)鍵成分含量不合理，或者裂解液用量不足，也會造成細(xì)胞裂解不完全，影響樣品中重組蛋白的獲取量。
（2）防止過度裂解：
物理破碎時，超聲功率過大、超聲時間過長，則可能破壞重組蛋白的結(jié)構(gòu)完整性，使其發(fā)生變性、降解等情況，影響后續(xù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。比如一些對剪切力敏感的蛋白，長時間高強度超聲會導(dǎo)致其功能喪失、條帶出現(xiàn)異常等。
化學(xué)裂解中，裂解液作用時間過長，尤其是其中含有的一些蛋白酶激活劑等成分在長時間作用下，可能會引發(fā)蛋白的過度水解，導(dǎo)致最終檢測到的蛋白含量和狀態(tài)與實際表達(dá)情況不符。
2、蛋白提取與收集環(huán)節(jié)
（1）避免蛋白丟失：
在收集裂解后的上清液時，如果操作不規(guī)范，比如吸取上清液時過于靠近沉淀部分，容易將沉淀重新攪起混入上清，后續(xù)再次離心去除沉淀的操作若不到位，會使雜質(zhì)增多影響檢測；或者吸取上清液時沒有將應(yīng)收集的部分完全吸盡，導(dǎo)致部分含重組蛋白的上清液遺漏，造成蛋白量的損失，影響檢測結(jié)果的代表性。
轉(zhuǎn)移蛋白樣品到新的容器過程中，若容器壁有殘留未沖洗下來，或者多次轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)灑漏等情況，都會使蛋白量減少，進(jìn)而干擾對表達(dá)情況的準(zhǔn)確判斷。
（2）防止蛋白降解：
整個提取收集過程沒有在合適的低溫環(huán)境下（如冰上操作）進(jìn)行，尤其是一些本身不穩(wěn)定、容易被蛋白酶降解的重組蛋白，較高的溫度會激活體系內(nèi)的蛋白酶，加速蛋白的降解，使得最終檢測到的蛋白量偏低，不能真實反映其表達(dá)水平。
未及時添加蛋白酶抑制劑，在蛋白提取收集的時間內(nèi)，蛋白酶可能持續(xù)發(fā)揮作用，不斷分解重組蛋白，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。
3、樣品處理及上樣準(zhǔn)備環(huán)節(jié)
（1）避免雜質(zhì)污染：
使用的耗材（如離心管、移液槍頭）沒有經(jīng)過嚴(yán)格的清洗、滅菌等預(yù)處理，可能帶有灰塵、微生物等雜質(zhì)，混入蛋白樣品中，在SDS-PAGE等檢測時會出現(xiàn)額外的雜帶，干擾對重組蛋白條帶的觀察和分析。
加入樣品處理試劑（如Loading Buffer等）時，若試劑本身受到污染，或者加入的量不準(zhǔn)確，都可能改變樣品的性質(zhì)，影響后續(xù)電泳等過程的正常進(jìn)行以及結(jié)果的準(zhǔn)確性。
（2）防止蛋白濃度誤差：
蛋白定量操作不準(zhǔn)確，如采用的比色法（如Bradford 法等）測定蛋白濃度時，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制不精確、樣品檢測時吸光度讀數(shù)有偏差等情況，會導(dǎo)致對蛋白樣品實際濃度判斷失誤，進(jìn)而影響上樣量的準(zhǔn)確控制，最終影響檢測結(jié)果中重組蛋白條帶的強度等指標(biāo)，不利于準(zhǔn)確評估表達(dá)情況。
在根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行上樣量調(diào)整時，如果計算失誤或者移液操作不精準(zhǔn)，上樣量過多或過少都不能很好地呈現(xiàn)蛋白真實的表達(dá)水平，上樣量過多可能導(dǎo)致條帶彌散、拖尾等現(xiàn)象，上樣量過少則可能使條帶難以清晰顯示。
