蛋白表達純化過程中，會通過哪些指標評估蛋白質量（如純度、活性、分子量、穩定性等），檢測方法分別是什么？

日期：2025-09-18 16:09:14

在蛋白表達純化過程中，蛋白質量的評估是確保其后續應用（如結構解析、功能研究、藥物開發、診斷試劑制備等）可靠性的核心環節。評估指標需覆蓋純度、活性、分子量、穩定性、完整性、濃度、均一性等多個維度，不同指標對應多種成熟的檢測方法。以下是詳細分類及說明：

一、核心評估指標及對應檢測方法

1. 純度（Purity）：衡量目標蛋白中雜蛋白的含量

純度是蛋白質量的基礎指標，直接影響后續實驗的準確性（如避免雜蛋白干擾活性檢測）。

檢測方法	原理	優勢	局限性/適用場景
SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）	蛋白在變性條件下（SDS+巰基乙醇）按分子量分離，通過考馬斯亮藍/銀染顯色，目標蛋白條帶占總條帶的比例即為純度（半定量）。	操作簡單、成本低、直觀可同時初步判斷分子量	半定量（誤差±10%）無法區分分子量相近的雜蛋白
HPLC（高效液相色譜）反相/離子交換	基于蛋白疏水性（反相）或電荷（離子交換）差異，通過色譜柱分離，主峰面積占比即為純度（定量）。	高分辨率、準確定量（誤差±2%）可檢測微量雜蛋白（<0.1%）	成本較高反相HPLC需有機相，可能影響蛋白活性
考馬斯亮藍染色法（Bradford法）結合超濾	先通過超濾分離目標蛋白與小分子雜質，再用Bradford法測定總蛋白與目標蛋白濃度，計算純度。	適用于去除小分子雜質后的純度評估	無法區分大分子雜蛋白（如其他球蛋白）
WesternBlot（免疫印跡）	用特異性抗體檢測目標蛋白，通過條帶有無/強度判斷雜蛋白是否存在（定性/半定量）。	極高特異性（僅識別目標蛋白）	半定量無法檢測抗體不識別的雜蛋白

2. 活性（Activity）：衡量蛋白生物學功能的完整性

活性是功能性蛋白（如酶、抗體、受體）的核心指標，需根據蛋白類型選擇針對性方法。

蛋白類型	檢測方法	原理	示例
酶類蛋白	底物顯色法/熒光法	利用酶對特異性底物的催化作用，通過吸光度/熒光強度變化計算酶活（單位：U/mg）。	蛋白酶：檢測酪蛋白降解后釋放的氨基酸（福林酚法）激酶：檢測ATP磷酸基團轉移到底物的量（放射性同位素法）
抗體類蛋白	ELISA（酶聯免疫吸附法）	用抗原包被板，加入抗體后通過酶標二抗顯色，計算抗體結合活性（EC50值）。	單克隆抗體：檢測與腫瘤抗原（如Her2）的結合能力
受體類蛋白	配體結合實驗（BLI/SPR）	用生物層干涉技術（BLI）或表面等離子體共振（SPR），實時監測受體與配體的結合動力學（親和力KD值）。	G蛋白偶聯受體（GPCR）：檢測與小分子配體的結合速率與解離速率
結構蛋白（如膜蛋白）	功能性整合實驗	檢測蛋白是否能正確組裝到膜上并維持結構功能（如離子通道的電生理活性）。	離子通道蛋白：通過膜片鉗技術檢測離子通透性

3. 分子量（Molecular Weight, MW）：驗證目標蛋白的正確性（避免降解 / 聚集）

檢測方法	原理	優勢	局限性
SDSPAGE（還原/非還原條件）	還原條件（加巰基乙醇）：斷裂二硫鍵，檢測單體分子量；非還原條件：保持蛋白天然聚合狀態，檢測寡聚體分子量。	快速、直觀、成本低	誤差較大（±5%10%），需結合蛋白Marker對比
質譜（MALDITOF/ESIMS）	蛋白離子化后，根據質荷比（m/z）計算精確分子量。	極高精度（誤差<0.1%）可同時檢測翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化）	成本高無法檢測大分子量聚合體（>200kDa，ESIMS除外）
凝膠過濾色譜（GFC/SEC）	蛋白按Stokes半徑（與分子量正相關）通過凝膠柱，與標準分子量蛋白對比，計算表觀分子量。	可同時分析蛋白聚集狀態（如單體/二聚體）	表觀分子量受蛋白形狀影響（如纖維蛋白與球形蛋白結果差異大）

4. 穩定性（Stability）：衡量蛋白在儲存 / 實驗條件下的保持能力

穩定性決定蛋白的儲存周期和應用場景（如是否適合長期冷凍、室溫操作）。

檢測維度	檢測方法	原理	評估指標
熱穩定性	差示掃描量熱法（DSC）	監測蛋白隨溫度升高的熱變性過程，記錄變性溫度（Tm值）。	Tm值越高，熱穩定性越強（如抗體Tm>65℃為合格）
儲存穩定性	加速穩定性試驗	在不同條件（4℃/25℃/37℃、pH5.08.0、高鹽/低鹽）下儲存，定期檢測純度、活性、聚集率。	4℃儲存3個月，活性保留率>90%為合格
聚集穩定性	動態光散射（DLS）	檢測蛋白顆粒的hydrodynamicradius，計算聚集率（多分散指數PDI）。	PDI<0.2為單分散（無聚集），PDI>0.5為嚴重聚集
化學穩定性	圓二色譜（CD）	檢測蛋白二級結構（α螺旋、β折疊）的變化，反映化學變性劑（如尿素、胍鹽）對結構的影響。	二級結構含量變化<10%為穩定

5. 其他關鍵指標

指標	檢測目的	常用方法
完整性（Integrity）	驗證蛋白是否存在降解、斷裂或錯誤剪切	WesternBlot（檢測是否有降解片段）質譜（分析序列覆蓋度，需100%覆蓋目標序列） N/C端測序（確認兩端氨基酸是否正確）
濃度（Concentration）	定量蛋白量，用于后續實驗（如活性檢測、結晶）	BCA法（適用于所有蛋白，抗干擾能力強） Bradford法（適用于球形蛋白，受去污劑干擾） UV280法（利用色氨酸/酪氨酸的紫外吸收，快速但受核酸干擾）
均一性（Homogeneity）	驗證蛋白是否為單一構象/聚合狀態	凝膠過濾色譜（GFC）：單一主峰為均一動態光散射（DLS）：PDI<0.2 分析型超速離心（AUC）：單一沉降峰
翻譯后修飾（PTM）	檢測糖基化、磷酸化等修飾（影響活性/穩定性）	質譜（MALDITOF/ESIMS，精準鑒定修飾位點）糖電泳（檢測糖基化水平）磷酸酶處理結合SDSPAGE（驗證磷酸化）