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熒光素標記的流式抗體在使用過程中,如何避免光漂白現象影響信號強度?操作時需采取哪些避光措施?

日期:2025-09-16 17:05:43

    熒光素標記的流式抗體在使用中,光漂白(熒光分子受激發光照射后,光子能量導致化學結構破壞,熒光強度隨時間衰減的現象)是導致信號減弱、數據準確性下降的核心問題之一。其本質是熒光基團(如FITC、PE、APC等)的光化學不穩定性,需通過 “減少激發光暴露” 和 “優化操作流程” 雙維度規避,具體原理與實操措施如下:

一、先明確:不同熒光素的光漂白敏感性差異(規避的基礎)

    不同熒光素對光的耐受度不同,選擇時需優先關注其光穩定性,從源頭降低漂白風險。常見流式熒光素的光穩定性排序(由高到低)如下:

    APC/Cy7 > PE/Cy7 > APC > PE > PerCP-Cy5.5 > FITC > Alexa Fluor 488 > Pacific Blue

    例如:FITC(異硫氰酸熒光素)對可見光(尤其藍光)極敏感,10分鐘室溫暴露即可出現明顯漂白;而APC(別藻藍蛋白)為藻膽蛋白類,光穩定性顯著優于小分子有機熒光素。

    核心邏輯:光穩定性差的熒光素(如FITC)需更嚴格的避光措施,光穩定性強的(如 APC)可適當放寬,但仍需基礎避光。

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二、全流程避光操作:從 “抗體準備” 到 “上機檢測” 的關鍵措施

    光漂白的影響貫穿 “抗體孵育→樣本洗滌→上機前等待→流式檢測” 全流程,需針對每個環節設計避光方案:

1. 抗體儲存與稀釋階段:阻斷 “預漂白”

    儲存避光:熒光標記抗體出廠時通常為棕色管或鋁箔包裹,需嚴格按說明書(如 4℃避光或-20℃分裝冷凍)儲存,避免反復凍融(凍融會破壞抗體結構,間接降低熒光信號)。

    稀釋避光:稀釋抗體時,需在避光環境(如超凈臺內關閉紫外燈、拉上遮光簾,或使用避光離心管)中操作,稀釋后立即使用,避免室溫敞口放置(尤其避免陽光、日光燈直射)。

 

2. 抗體孵育階段:核心避光環節

    孵育是細胞與抗體結合的關鍵步驟,若暴露于光下,未結合的游離熒光素和已結合的抗體均會發生漂白,直接導致陽性信號減弱。

    環境避光:將孵育管/板置于避光盒、錫箔紙包裹的容器或暗室中,避免實驗室日光燈、顯微鏡光源、陽光照射。

    溫度與時間控制:多數流式抗體孵育條件為 “4℃避光30分鐘~1小時”(4℃可降低分子運動速率,減少非特異性結合,同時減緩光化學反應速率);若需室溫孵育,需縮短至15~20分鐘,并全程嚴格避光。

    避免開蓋觀察:孵育過程中不要頻繁打開避光容器查看,減少光暴露次數。

 

3. 樣本洗滌與離心階段:減少殘留熒光素的漂白

    洗滌的目的是去除未結合的游離熒光素(這類熒光素若殘留,會增加背景信號,且其漂白產物可能干擾檢測),此階段需注意:

    離心環境:離心時將離心機置于避光處(如實驗室角落,遠離光源),或用錫箔紙包裹離心轉子(避免離心過程中樣本受環境光照射)。

    洗滌液避光:洗滌用的PBS或流式緩沖液(含BSA、EDTA)需避光儲存,使用時現取現用,避免長時間敞口暴露。

    快速操作:洗滌時盡量縮短樣本在空氣中的暴露時間,離心后迅速棄上清、加入緩沖液重懸,全程在避光環境下進行。

 

4. 上機前等待與檢測階段:避免 “最后一步” 漂白

    上機前儲存:樣本制備完成后,若無法立即上機,需將樣本置于4℃避光環境中,且等待時間不超過 1 小時(長時間儲存不僅可能導致光漂白,還可能因細胞沉降、死亡影響散射光信號)。

    流式儀操作:

        開機后先校準儀器(確保激光強度、檢測器靈敏度穩定),再加載樣本,減少樣本在激光下的預暴露時間;

        樣本加載后立即開始檢測,避免樣本在進樣器中長時間靜置(部分流式儀進樣器有避光設計,但仍需快速檢測);

        檢測完成后,及時卸載剩余樣本,避免樣本繼續受激光或環境光照射。

 

三、額外優化策略:進一步降低光漂白影響

    除了操作層面的避光,還可通過以下方法增強熒光信號穩定性:

    使用抗光漂白劑:若需長時間孵育或樣本制備后需延遲檢測,可在流式緩沖液中加入專用的抗光漂白劑(如含抗氧化劑、自由基清除劑的試劑,需選擇與流式檢測兼容的產品,避免影響細胞活性或抗體結合)。

    選擇高穩定性熒光素衍生物:例如,Alexa Fluor系列(如Alexa Fluor 488、647)的光穩定性優于傳統FITC、PE,可優先選擇(需注意與流式儀激光波長匹配,如Alexa Fluor 488需藍光激發,Alexa Fluor 647需紅光激發)。

    優化抗體濃度:抗體濃度過高會導致非特異性結合增加,過低則信號弱,需通過預實驗確定最佳濃度(最佳濃度下,陽性信號最強、背景最低,可減少因信號過弱導致的 “漂白后無信號” 問題)。

 

避光操作的核心原則

    光漂白的影響與 “光強度×暴露時間” 正相關,因此所有措施的核心邏輯是:在不影響抗體結合效率和細胞活性的前提下,最大限度降低光強度(選擇避光環境)、縮短暴露時間(優化操作流程) 。

    對于光穩定性差的熒光素(如FITC、Pacific Blue),需執行 “全流程嚴格避光”;對于光穩定性強的熒光素(如 APC、PE/Cy7),雖可適當放寬,但基礎的 “孵育避光、上機前避光” 仍需遵守,才能確保流式數據的準確性和重復性。