重組蛋白在原核系統（如大腸桿菌）中大量形成包涵體是常見問題，其本質是蛋白表達速度過快、折疊環境（如二硫鍵形成障礙、分子伴侶不足）導致的錯誤折疊聚集體。處理需通過 “變性溶解→純化→復性” 三步核心流程，最終恢復蛋白的天然結構與活性，各步驟關鍵操作及復性參數控制如下：

一、包涵體處理前的預處理：分離與洗滌（減少雜質干擾）

    包涵體雖主要成分為目標蛋白（含量可達50%~90%），但常混雜細菌細胞膜碎片、核酸、脂類等雜質，若不提前去除，會影響后續變性溶解效率及復性純度，需先進行分離與洗滌：

    菌體裂解：通過超聲破碎、高壓勻漿或溶菌酶處理，將表達目標蛋白的大腸桿菌裂解，釋放胞內包涵體（包涵體密度較高，易通過離心分離）。

    包涵體分離：4℃下10,000~15,000×g離心20~30分鐘，棄上清（含可溶性雜質），沉淀即為包涵體粗品。

    反復洗滌：用含低濃度變性劑（如0.5% Triton X-100、2~4 M尿素）或去垢劑的洗滌緩沖液（通常含50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA，可加蛋白酶抑制劑防止蛋白降解）重懸沉淀，再次離心收集包涵體，重復2~3次。

        目的：去除附著在包涵體表面的膜蛋白、核酸等雜質，避免其在后續變性溶解時與目標蛋白共溶，增加純化難度。

二、核心流程：變性溶解→純化→復性

步驟 1：變性溶解 —— 打破包涵體聚集體，釋放目標蛋白

    包涵體的聚集體由錯誤折疊的蛋白通過疏水相互作用、二硫鍵錯配形成，需用高濃度變性劑破壞這些非共價鍵，使蛋白解聚為線性單鏈（變性狀態）：

    常用變性劑及濃度：

       尿素（6~8M）：溫和變性劑，通過破壞氫鍵溶解蛋白，成本低、易去除，適合多數不含復雜二硫鍵的蛋白；

        鹽酸胍（5~6M）：強變性劑，可破壞疏水相互作用和氫鍵，溶解能力優于尿素，適合難溶解的包涵體（如含多對二硫鍵的蛋白），但成本較高，且對后續復性緩沖液pH影響較大；

        輔助試劑：若蛋白含二硫鍵，需加入還原劑（如50~100mM β-巰基乙醇、5~10mM DTT） ，打開錯配的二硫鍵，為復性時正確配對做準備；同時加入1mM EDTA螯合金屬離子，防止蛋白氧化。

    操作條件：室溫或4℃下，用變性緩沖液重懸包涵體，磁力攪拌2~4小時（或 4℃過夜），確保充分溶解；溶解后12,000×g離心30分鐘，棄未溶解沉淀，上清即為變性的目標蛋白溶液。

 

步驟 2：變性狀態下純化 —— 去除雜蛋白（可選但推薦）

    若目標蛋白帶有標簽（如His-tag、GST-tag），建議在變性狀態下通過親和層析（如Ni-NTA柱、GST柱）純化：

    優勢：減少復性后雜蛋白對目標蛋白活性的干擾，同時提高目標蛋白濃度，降低復性難度；

    注意事項：純化柱需兼容高濃度變性劑（如Ni-NTA柱可耐受8M尿素、6M鹽酸胍），洗脫緩沖液需與變性緩沖液成分一致（避免因變性劑濃度驟變導致蛋白提前析出）。

 

步驟 3：復性 —— 恢復蛋白天然結構與活性

    復性是核心難點，需通過 “緩慢降低變性劑濃度”，為線性蛋白鏈提供足夠時間折疊為天然構象，同時促進正確二硫鍵形成。常用復性方法及關鍵參數控制如下：
三、復性方法與關鍵控制參數

    不同蛋白的折疊需求差異大，需根據蛋白分子量、二硫鍵數量、疏水性等特性選擇復性方法，同時嚴格控制以下關鍵參數：

1. 常用復性方法對比

復性方法	原理	優點	缺點	適用場景
透析復性	利用半透膜，通過梯度降低外液變性劑濃度，使蛋白緩慢折疊	操作簡單、溫和，可批量處理，變性劑去除徹底	耗時久（12~48 小時），易產生蛋白沉淀，復性效率中等	分子量較小（<50 kDa）、疏水性較低的蛋白
稀釋復性	將變性蛋白溶液快速或緩慢稀釋到復性緩沖液中，降低變性劑濃度	操作快速（幾分鐘到幾小時），復性效率較高	樣品體積大幅增加（需后續濃縮），試劑消耗多，不適合大量樣品	小體積樣品、復性條件明確的蛋白
柱上復性	變性蛋白結合到層析柱（如Ni-NTA、凝膠過濾柱）上，通過梯度洗脫降低變性劑濃度，在柱內折疊	減少蛋白聚集（柱基質提供空間屏障），復性后可直接純化	需特殊層析柱，操作復雜，成本高	易聚集、難復性的蛋白（如多結構域蛋白）
添加輔助復性劑	在復性緩沖液中加入促進折疊的試劑，減少聚集	顯著提高復性效率，降低沉淀風險	需篩選輔助劑種類和濃度，可能影響后續純化	幾乎所有蛋白，尤其易聚集的蛋白

2. 復性過程中的關鍵控制參數（核心！）

    無論選擇哪種復性方法，以下參數直接決定復性成功率，需逐一優化：

    參數 1：變性劑去除速率

    變性劑濃度驟降會導致蛋白快速折疊，疏水基團暴露過多，易重新聚集；速率過慢則可能導致錯誤折疊。

        透析復性：建議分2~3步梯度降低變性劑濃度（如8M尿素→4M尿素→2M尿素→0M尿素，每步透析4~8小時）；

        稀釋復性：采用 “緩慢滴加”（用蠕動泵將變性蛋白溶液以0.5~1mL/min速度滴入復性緩沖液，同時攪拌），或分多次稀釋（每次稀釋后孵育30分鐘，再進行下一次稀釋）。

 

    參數 2：復性溫度

    溫度影響蛋白折疊速率和聚集速率：

        低溫（4℃）：降低分子運動速率，減少聚集，但折疊效率低、耗時久；

        室溫（20~25℃）：折疊速率適中，適合多數蛋白；

        高溫（>30℃）：易導致蛋白變性或聚集，僅少數耐熱蛋白適用。

        建議：優先選擇 4℃或室溫，通過預實驗驗證最佳溫度。

 

    參數 3：目標蛋白濃度

    蛋白濃度過高會增加分子間碰撞概率，導致聚集；濃度過低則復性效率低、后續濃縮成本高。

        最佳濃度：通常為0.1~0.5mg/mL（需通過預實驗篩選，如測試0.05、0.1、0.5、1mg/mL濃度的復性效率）；

        控制方法：若變性蛋白濃度過高，可先用變性緩沖液稀釋至目標濃度后再復性。

 

    參數 4：pH 值與離子強度

        pH值：需接近蛋白的等電點（pI）附近（但避免 pI，防止蛋白沉淀），通常為 pH7.0~8.5（多數蛋白的穩定pH范圍），需通過緩沖液（如Tris-HCl、HEPES）控制；

        離子強度：適當的鹽濃度（如50~150mM NaCl）可減少蛋白間的靜電排斥，促進正確折疊，但高鹽（>500mM）可能導致蛋白沉淀，需根據蛋白特性調整。

 

    參數 5：二硫鍵形成控制（針對含二硫鍵的蛋白）

    原核系統無內質網，無法正確形成二硫鍵，復性時需通過 “氧化還原系統” 促進正確配對：

        常用系統：氧化型谷胱甘肽（GSSG）/還原型谷胱甘肽（GSH） （摩爾比 1:5~1:10，濃度總合1~10mM），或半胱氨酸/胱氨酸（摩爾比1:1，濃度5~20 mM）；

        作用：GSH打開錯配的二硫鍵，GSSG促進正確二硫鍵形成，平衡氧化還原環境，減少聚集體。

 

    參數 6：輔助復性劑的選擇

    加入輔助劑可顯著提高復性效率，常見類型：

        分子伴侶（如GroEL、DnaK）：模擬體內折疊環境，幫助蛋白正確折疊，但成本高；

        去垢劑（如 0.1%~0.5% Tween-20、Triton X-100）：掩蓋蛋白疏水基團，減少聚集，適合疏水性強的蛋白；

       滲透壓調節劑（如 0.4~1M 蔗糖、甘油）：增加溶液滲透壓，穩定蛋白折疊中間態；

        脯氨酸（0.1~1M）：抑制蛋白聚集，尤其適合抗體片段、酶類蛋白。

 

四、復性后的驗證與后續處理

    復性效率驗證：

        溶解度檢測：復性后12,000×g 離心10分鐘，若上清澄清，說明蛋白未聚集（溶解度合格）；

        活性檢測：通過ELISA、酶活測定、熒光光譜等方法，驗證目標蛋白是否具有天然活性（核心指標，溶解度合格不代表活性合格）；

        純度檢測：通過SDS-PAGE、HPLC檢測目標蛋白純度，若含雜蛋白，需進一步純化（如離子交換層析、凝膠過濾層析）。

    濃縮與儲存：

    復性后的蛋白濃度通常較低，需用超濾管（如3kDa、10kDa 截留分子量）濃縮至目標濃度（如1~10mg/mL），儲存于含防腐劑（如0.02%疊氮鈉）的緩沖液中，4℃短期儲存或-80℃長期儲存（避免反復凍融）。

 

包涵體處理的核心邏輯

    包涵體處理的關鍵是 “緩慢變性溶解→溫和復性→精準參數控制”：

    變性階段需徹底溶解包涵體，同時保護蛋白不被降解；

    復性階段需通過梯度降低變性劑濃度、優化溫度/pH/濃度、添加輔助劑，平衡 “折疊效率” 與 “聚集風險”；

    最終需通過活性驗證確認復性成功，而非僅關注溶解度。

    對于難復性蛋白（如多二硫鍵、大分子量蛋白），可能需要多次篩選復性條件，或嘗試真核表達系統（如酵母、昆蟲細胞）避免包涵體形成。