如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行表達(dá)與復(fù)性?
日期：2023-06-06 13:41:30
包涵體蛋白表達(dá)與復(fù)性的過(guò)程中，需要進(jìn)行以下步驟：
一、基因克隆
1、選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體
常見(jiàn)的質(zhì)粒載體有pET系列、pGEX系列等。根據(jù)需要選擇含有不同誘導(dǎo)子和選擇標(biāo)記的質(zhì)粒載體。
2、擴(kuò)增目的基因
將目的基因擴(kuò)增后，將其接入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)上。這一步可以通過(guò)PCR方法來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，也可以通過(guò)化學(xué)合成的方式獲取到序列完整、長(zhǎng)度合適的基因片段。同時(shí)，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，應(yīng)考慮到靶基因的大小和構(gòu)建的質(zhì)粒載體的限制酶切位點(diǎn)的配對(duì)問(wèn)題。
3、活性測(cè)定
在將目的基因接到質(zhì)粒載體后，可進(jìn)行限制性酶切鑒定、DNA測(cè)序鑒定等活性測(cè)定，以確定目的基因序列是否正確。
二、轉(zhuǎn)化
將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，使其在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)化方法有化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法和熱激轉(zhuǎn)化法等。
三、篩選陽(yáng)性克隆株
轉(zhuǎn)化后需要對(duì)大腸桿菌進(jìn)行篩選。常用的方法是在含有抗生素的LB平板上篩選，含有適合質(zhì)粒載體選擇標(biāo)記的抗生素（如氨芐青霉素、卡那霉素）。
四、包涵體蛋白表達(dá)
1、預(yù)培養(yǎng)
將大腸桿菌陽(yáng)性克隆株接入到LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，通常為37℃、200-250rpm振蕩培養(yǎng)。
2、誘導(dǎo)表達(dá)
當(dāng)大腸桿菌發(fā)展到指定的OD600值時(shí)，添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行表達(dá)。在此過(guò)程中應(yīng)選擇合適的誘導(dǎo)濃度和時(shí)間，不同的質(zhì)粒載體可能對(duì)誘導(dǎo)劑的反應(yīng)存在差異。
3、加入輔酶
輔酶對(duì)于某些蛋白質(zhì)表達(dá)至關(guān)重要。如在pET質(zhì)粒中，可以添加輔酶T7。
4、分析表達(dá)
通過(guò)采集樣品、離心、液氮凍存等方法來(lái)分析蛋白表達(dá)的情況，如采用SDS-PAGE技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，并采用Western blotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
五、包涵體蛋白復(fù)性
1、包涵體蛋白的裂解
將表達(dá)的細(xì)菌分裝至每個(gè)離心管中，采用超聲波、熱激或流體剪切的方法進(jìn)行細(xì)胞裂解。對(duì)于不同類(lèi)型的包涵體蛋白，應(yīng)選擇不同的裂解方式和時(shí)間。
2、去除雜質(zhì)
將細(xì)胞裂解物經(jīng)過(guò)離心去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，得到含有包涵體的上清液。
3、包涵體蛋白的再溶解
使用緩沖液將包涵體溶解后，使用Refolding Buffer進(jìn)行復(fù)性。Refolding Buffer通常包括還原劑如DTT等，以促進(jìn)蛋白的還原和復(fù)性。
4、蛋白純化
復(fù)性過(guò)程完成后，使用親和層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等方法來(lái)純化復(fù)性的蛋白質(zhì)。
通過(guò)以上步驟，可以較為可靠地實(shí)現(xiàn)包涵體蛋白表達(dá)與復(fù)性，并進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。
