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樣本中存在干擾物質時,ELISA試劑盒的檢測結果會出現假陽性,如何通過試劑盒設計或樣本預處理消除此類干擾?

日期:2025-11-24 14:20:20

    當ELISA檢測中存在異嗜性抗體(HAMA)、類風濕因子(RF)等干擾物質時,假陽性的核心成因是干擾物質與試劑盒中的抗體(捕獲/檢測抗體、酶標二抗)發生非特異性結合(如RF可同時結合抗體的Fc段,HAMA可跨物種結合鼠源/兔源抗體)。解決思路需從試劑盒設計優化(主動阻斷干擾)和樣本預處理(提前去除干擾物)兩方面入手,以下是具體技術方案及原理:
 
一、試劑盒設計層面:加入阻斷劑或優化抗體/反應體系
    試劑盒設計是從源頭減少干擾的核心,通過在試劑中添加特異性阻斷劑、優化抗體類型等,阻斷干擾物質與檢測抗體的非特異性結合,不影響目標抗原-抗體的特異性反應。
 
1.針對異嗜性抗體(HAMA)的阻斷設計
    異嗜性抗體多為針對動物源性抗體(如鼠、兔、羊)的多克隆抗體,可同時結合捕獲抗體和酶標二抗的恒定區(Fc段),形成“捕獲抗體-HAMA-酶標二抗”的假陽性復合物。
 
核心阻斷策略:添加動物血清/IgG阻斷劑(最常用)
    原理:在反應體系中加入過量的、與試劑盒抗體同源的動物血清(如試劑盒抗體為鼠源,則加入正常鼠血清)或純化IgG,優先占據HAMA的結合位點,使其無法再結合檢測抗體的Fc段。
 
具體方案:
    在包被液、封閉液或樣本稀釋液中添加1-5%的同源動物血清(如鼠血清、兔血清);
    若試劑盒使用多種動物源抗體(如鼠源捕獲抗體+羊源酶標二抗),可添加“混合動物血清”(如鼠+羊血清)或商業化HAMA阻斷劑(如Sigma的HAMABlockingReagent)。
    輔助優化:使用“Fab片段抗體”作為檢測抗體
    原理:Fab片段僅含抗原結合區(無Fc段),而異嗜性抗體主要結合Fc段,因此使用Fab片段可避免HAMA的非特異性結合,從根本上消除此類干擾。
 
2.針對類風濕因子(RF)的阻斷設計
    RF是針對人IgGFc段的自身抗體,可同時結合樣本中可能存在的內源性IgG(或檢測體系中的人源抗體)和酶標二抗的Fc段,形成“內源性IgG-RF-酶標二抗”的假陽性復合物。
 
核心阻斷策略:添加人IgG阻斷劑或抗RF抗體
    方案1:在樣本稀釋液中加入過量純化人IgG(1-10mg/mL),優先與RF結合,占據其結合位點,阻止RF與檢測體系中的IgG(如捕獲抗體為抗人IgG時)或酶標二抗結合;
    方案2:使用抗RF單克隆抗體作為阻斷劑,特異性結合樣本中的RF并中和其活性,避免其介導非特異性交聯。
    輔助優化:優化反應pH和離子強度
    RF的非特異性結合依賴于Fc段的構象,通過調整反應緩沖液的pH(如5.5-6.0,偏離RF的最適結合pH)或增加NaCl濃度(0.15-0.5M),可減弱RF與抗體的非特異性相互作用。
 
3.通用型阻斷設計(同時應對多種干擾)
    添加封閉蛋白混合物:在封閉液中除了常規的BSA、脫脂奶粉外,加入少量動物血清(如5%胎牛血清)、魚明膠或酪蛋白,形成更致密的封閉層,覆蓋酶標板上未結合抗體的位點,同時競爭性結合樣本中的非特異性結合物質(包括HAMA、RF、其他雜抗體)。
    使用“阻斷緩沖液”作為樣本稀釋液:將樣本用含高濃度封閉劑的緩沖液稀釋(如含2%BSA+1%鼠血清+0.05%Tween-20的PBS),既降低樣本中干擾物質的濃度,又通過封閉劑提前占據干擾物質的結合位點。
 
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二、樣本預處理層面:提前去除或中和干擾物質
    對于干擾物質濃度較高的樣本(如類風濕關節炎患者血清、多次接受動物源性抗體治療的患者樣本),僅靠試劑盒阻斷可能效果有限,需在檢測前對樣本進行預處理,直接去除或中和干擾物。
 
1.針對HAMA的樣本預處理
方法1:親和層析去除HAMA
    原理:使用與試劑盒抗體同源的動物IgG(如鼠IgG)偶聯的瓊脂糖凝膠柱,樣本過柱時,HAMA會特異性結合到凝膠上的鼠IgG,而目標抗原則穿透柱子被收集,從而實現分離。
    簡化方案:使用商品化的HAMA去除試劑盒(如Thermo的HAMARemovalSpinColumns),操作快速,適合小批量樣本。
 
方法2:樣本與動物IgG預孵育
    操作:將樣本與過量的同源動物IgG(如1mg/mL鼠IgG)在室溫下孵育30分鐘,讓HAMA充分結合鼠IgG,再將孵育后的樣本加入ELISA反應體系,此時HAMA已被中和,無法結合檢測抗體。
 
2.針對RF的樣本預處理
方法1:熱變性滅活RF
    原理:RF的活性依賴于其天然構象,將樣本置于56℃水浴30分鐘,可使RF的空間結構破壞而失活,同時不影響大多數抗原(如蛋白質類抗原)的活性。
注意:需驗證目標抗原的熱穩定性,若抗原對熱敏感(如激素、細胞因子),則避免此方法。
 
方法2:親和吸附去除RF
    原理:使用人IgG偶聯的瓊脂糖凝膠(如ProteinA/G瓊脂糖,可結合IgG的Fc段),樣本過柱時,RF會特異性結合人IgG,而目標抗原(若為非IgG類物質)則被收集。
適用場景:目標抗原不是IgG(如小分子抗原、細胞因子),若目標抗原是IgG(如檢測自身抗體),則需避免(會同時去除目標抗原)。
 
方法3:使用RF吸附劑
    商品化RF吸附劑(如抗人RF抗體偶聯磁珠),可特異性結合樣本中的RF,通過磁分離去除,操作簡便,不影響目標抗原。
 
3.通用型樣本預處理(應對多種干擾)
方法1:PEG沉淀去除大分子干擾物
    原理:HAMA、RF多為大分子免疫球蛋白(IgG、IgM類),而小分子目標抗原(如分子量<10kDa的細胞因子)可通過PEG沉淀分離。
    操作:向樣本中加入PEG6000至終濃度8-10%,4℃靜置30分鐘后離心(10000g,10分鐘),取上清液檢測(上清中含目標抗原,沉淀中含大分子干擾物)。
方法2:樣本稀釋法
    原理:干擾物質的非特異性結合具有濃度依賴性,通過將樣本用ELISA稀釋液(含封閉劑)進行適當稀釋(如1:10、1:20),可降低干擾物質的濃度,使其非特異性結合能力減弱。
    注意:需確保目標抗原的濃度在試劑盒的檢測范圍內,避免稀釋后抗原濃度過低導致假陰性。
 
方法3:酸/堿處理中和干擾
    原理:部分干擾物質(如RF)在極端pH下會失活,而目標抗原可通過中和后恢復活性。
    操作:將樣本用0.1MHCl調至pH2.0,室溫孵育10分鐘,再用0.1MNaOH中和至pH7.4,離心后取上清檢測。
 
三、關鍵優化原則與驗證方法
阻斷劑/預處理方法的特異性:
    需驗證阻斷劑僅結合干擾物質,不與目標抗原或檢測抗體結合(如通過空白對照、抗原標準曲線驗證,確保添加阻斷劑后標準曲線的斜率、截距無顯著變化)。
避免過度阻斷:
    過量的阻斷劑(如高濃度動物血清)可能導致非特異性背景升高,需通過梯度實驗確定最佳濃度(如0.5%、1%、2%、5%的血清濃度梯度,選擇背景最低且信號無衰減的濃度)。
 
干擾驗證實驗:
    用已知含高濃度HAMA/RF的樣本(如類風濕關節炎患者血清、HAMA陽性對照品)進行驗證,比較處理前后的檢測結果,確保假陽性率顯著降低。

試劑盒兼容性:
    樣本預處理(如PEG沉淀、酸處理)可能影響樣本的基質,需驗證處理后的樣本與試劑盒的反應體系兼容(如通過回收實驗,添加已知濃度的抗原標準品,驗證回收率在80%-120%之間)。