不同來源的樣本使用RNA pulldown試劑盒時，處理方式有何差異？
日期：2025-11-13 17:15:23
細(xì)胞樣本以“直接裂解提取”為主，操作簡便；組織樣本需先經(jīng)研磨破碎處理，再進(jìn)行裂解，兩者的差異集中在樣本破碎、裂解條件和雜質(zhì)去除三步，最終均為獲得完整且高純度的RNA。
一、核心處理差異（細(xì)胞vs組織樣本）
1.樣本破碎步驟
細(xì)胞樣本：無需額外破碎，直接用裂解液處理即可。貼壁細(xì)胞可先胰酶消化收集，懸浮細(xì)胞直接離心富集，裂解液能快速滲透細(xì)胞膜釋放RNA。
組織樣本：必須先破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)。常用液氮研磨（最徹底，適合硬組織如肝臟、肌肉）或組織勻漿機(jī)（適合軟組織如脾臟、腦組織），避免組織塊導(dǎo)致RNA提取不完全。
2.裂解條件優(yōu)化
細(xì)胞樣本：裂解液用量少（如1×10^6細(xì)胞對應(yīng)100-200μL裂解液），裂解時間短（冰上5-10分鐘），無需額外輔助裂解試劑。
組織樣本：裂解液用量需增加（如100mg組織對應(yīng)300-500μL裂解液），可加入少量β-巰基乙醇或DTT增強(qiáng)裂解效果，冰上裂解15-20分鐘，期間需反復(fù)吹打分散組織碎片。
3.雜質(zhì)去除重點
細(xì)胞樣本：主要去除蛋白和DNA，常規(guī)酚-氯仿抽提或柱式純化即可滿足要求。
組織樣本：雜質(zhì)更多（如結(jié)締組織、脂類、多糖），需增加一步離心去除組織殘渣（12000rpm離心5分鐘取上清），脂類豐富的組織（如脂肪、腎上腺）需額外加入去脂試劑或增加洗滌次數(shù)。
二、共同處理原則
全程控RNase：所有耗材（離心管、槍頭）需無RNase，操作中佩戴手套，裂解液中添加RNase抑制劑，避免RNA降解。
RNA完整性保證：樣本處理全程冰上進(jìn)行，組織樣本破碎后立即加入裂解液，減少RNA暴露在空氣中的時間。
濃度純度要求：最終RNA純度需達(dá)到A260/A280=1.8-2.0，濃度≥50ng/μL，才能保證pulldown實驗中RNA與蛋白的有效結(jié)合。
三、實操注意事項
細(xì)胞樣本：消化貼壁細(xì)胞時，胰酶作用時間不宜過長，避免損傷細(xì)胞內(nèi)RNA。
組織樣本：液氮研磨時需避免樣本反復(fù)凍融，研磨后迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的裂解液中，防止RNA降解。
