標簽內參抗體能否用于免疫沉淀(IP)實驗,需注意哪些條件?
日期:2025-12-03 10:15:18
標簽內參抗體可以用于免疫沉淀(IP)實驗,但需滿足特定的抗體特性和實驗條件,同時要規避一些關鍵風險,具體如下:
1、能否用于IP實驗的核心前提
標簽內參抗體能否用于IP,首要取決于抗體的抗原結合表位及交聯方式:
若抗體識別的標簽表位(如His、Myc、Flag、HA等)在靶蛋白上呈暴露狀態,且抗體的可變區能在非變性/變性條件下穩定結合表位,即可用于IP;
需優先選擇經IP驗證的商品化標簽內參抗體,這類抗體的說明書會明確標注“適用于IP”,其Fc段或其他區域已做優化,避免非特異性結合或影響抗原-抗體復合物的沉淀。

2、實驗中需注意的關鍵條件
(1)抗體的選擇與預處理
避免使用僅適用于WB的標簽抗體,這類抗體多為識別變性表位的多抗/單抗,在天然構象下結合能力弱,無法有效沉淀靶蛋白;
若使用自制抗體,需提前通過ProteinA/G/L親和柱純化IgG組分,去除血清雜蛋白,減少非特異性沉淀。
(2)裂解液與緩沖體系
需使用溫和的非變性裂解液(如含1%NP-40、0.5%TritonX-100的裂解液),避免強變性劑(如SDS)和高鹽濃度,防止靶蛋白構象破壞或標簽表位遮蔽,同時保護抗體-抗原復合物的穩定性;
裂解液中需添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(若靶蛋白為磷酸化蛋白),防止靶蛋白降解或修飾位點丟失。
(3)沉淀載體的適配性
需選擇與抗體Fc段匹配的沉淀載體,如鼠源單抗用ProteinGbeads,兔源多抗用ProteinAbeads,也可使用偶聯抗標簽抗體的親和beads(如Anti-FlagM2beads),提升沉淀效率;
實驗前需用裂解液充分洗滌beads,去除載體自身的雜蛋白,降低背景污染。
(4)特異性與對照設置
必須設置陰性對照:包括無抗體的beads對照、正常IgG對照、無靶蛋白的細胞裂解液對照,用于排除非特異性結合;
若靶蛋白為融合蛋白,需設置僅含標簽的空載載體轉染細胞的裂解液對照,驗證抗體對標簽的特異性。
(5)洗脫與后續檢測
洗脫時可選擇溫和洗脫方式(如酸性洗脫液pH2.5~3.0、標簽肽競爭洗脫),避免強洗脫條件導致抗體和靶蛋白變性,影響后續WB驗證;
洗脫后需及時中和酸性洗脫液,或通過透析去除標簽肽,保證靶蛋白的活性和檢測準確性。
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